1895年间伦琴使用他的同行赫兹，西托夫，克鲁克斯和勒纳德设计的设备研究真空管中的高压放电效应。11月初伦琴重复着雷纳德管试验，这个雷纳德管加入了一个很窄的金属铝做的窗口，允许阴极射线从管子射出来，另外有块纸板覆盖住铝窗口保护它不被产生阴极射线的强电场区破坏。他知道纸屏能够防止光线逃逸，但是观察到当他用涂了氰亚铂酸钡的小纸屏靠近铝窗，看不到的阴极射线能够在纸屏上产生荧光效应。这让伦琴想到，比雷纳德管的管壁更厚的Hifforf-Crookes管可能也会导致荧光效应。

　　1895年11月8日，伦琴把实验室的门关的紧紧的，一个人在那里进行阴极射线的研究，在出现阴极射线时，旁边涂有氰化铂钡的荧光屏上，似乎也发出点蓝白色的光。阴极射线是不能通过玻璃管壁的，尤其是伦琴自己精心制造的装置，阴极射线漏出来也是不可能的。伦琴把玻璃管用黑纸紧紧地蒙上，通电后阴极射线发出的光被遮住了，氰化铂钡却依然发亮。断电时就不见了，伦琴用10张黑纸包着玻璃管或以铝板把玻璃第一张X光片管和荧光屏隔开，荧光屏仍亮着;把厚铅板夹在里面试试，亮光突然消失，铅板一拿开，又重新发亮。伦琴把手插进去一看，在荧光屏上模模糊糊有手骨的形象，手的轮廓也隐约可见，由于这是一种性质不明的新射线，就姑且称为“X线”。为了仔细研究X线，伦琴把床也搬进了实验室，整整7个星期，伦琴埋首在“X线”中。圣诞节前夕，夫人别鲁塔来到实验室，他把她的手放到照相底板上用“X线”照了一张照片，这是人类的第一张X线照片，伦琴亲自在照相底板上用钢笔写上1895，12，22。别鲁塔看到照片惊叹不已，问：“这个圆环是什么?”“是我们的结婚戒指”。这时他们完全沉醉幸福之中了。

　　1895年11月8日下午晚些时候，他决定试验他的想法。他仔细的做了一个跟雷纳德管试验类似的黑纸屏，并用这块版覆盖住Hifforf-Crookes管并把电极放到一个Ruhmkorff 线圈中来产生静电电荷。在用氰亚铂酸钡屏验证他的想法之前，伦琴把房间弄暗以检测是不是他的纸板漏光。当他把线圈穿过管子的时候，确定板子确实不透光，并着手进行下一步实验。就在这时， 他从距离试验管几米远的地方注意到微弱的光。为了确定他的发现，他试着重复上面的操作，每次都能看到同样的微光。 擦燃一根火柴，他才发现是他放在工作台上准备下一步使用的氰亚铂酸钡发光。

　　接下来的几个小时伦琴一遍一遍的重复着试验。他很快确定出一个距离管子特定的距离，从这里能够观察到比前面的试验更强的荧光。他推测可能发现了一种新的射线。11月8日是一个星期五，伦琴利用这个周末重复试验并做了第一次记录。在接下来的几个星期他吃住在实验室里研究了他暂时命名为 X射线的新射线的差不多所有性质，并用对未知的部分给出数学表示。尽管最终新的射线用他的名字来命名为伦琴射线，但是他总是首选最初的术语X射线。 伦琴发现X射线并非偶然，他也不是独自工作。据调查，当时多个国家不少人都在进行这方面的研究而且，发现时间也很接近。事实上，2年前宾夕发尼亚大学就已经制造出X射线和和它的影像记录。然而，那里的研究人员没有意识到这一发现的重要性，只是把他们归档了事，因此也就失去了获得最伟大物理发现的赞誉的机会。他碰巧在屏上发现的东西把他的注意力从原来的研究中引开了。他当时已经计划在下一步的试验中用那个屏，那之前很短时间他就取得了这一发现。

　　当他研究不同材料对这种射线的阻挡能力, 就把这一小片材料放到射线产生的地方。可以想象当看到第一张呈现在他制作的屏幕上的X光影像上闪烁的骨架的时候，伦琴是多么地惊讶。据说他后来在实验室秘密的进行这项试验，因为他害怕如果这个发现是个错误会影响他的教授声誉。

　　伦琴的原始论文《一种新的X射线》在50天后也就是1895年12月28日被出版。1896年1月5日 奥地利一家报纸报道了伦琴的发现。伦琴发现X射线以后，维尔兹堡大学授予他荣誉医学博士学位。在1895年到1897年间他一共出版了总计3篇关于X射线的论文。伦琴治学十分的严谨，到如今为止还没有发现他的学术论文里面存在错误。